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氢气吸入对急慢性肾脏损伤的作用

2022-08-04 09:59:02

 择用氢气吸入对模型进行验证,是对氢气治疗的极大尊敬。因为要判断一个新的动物模型是否成功,最重要的是用基本的病理学或病理生理学数据进行分析,其次就是用一种比较肯定有效的药物尝试治疗效果。既然选择氢气作为治疗方法,显然是作者对氢气有非常强的自信心。

论文来自日本滋庆大学医学院内科肾脏病与高血压科

Kinoshita Y, Shirakawa K, Sano M, et al. Development of a novel porcine ischemia/reperfusion model inducing different ischemia times in bilateral kidneys-effects of hydrogen gas inhalation Translational Andrology and Urology. 2022 Apr;11(4):430-438. PMCID: PMC9085936.


肾缺血再灌注损伤是急性肾损伤的主要病理基础之一,已有许多动物模型被用于研究。肾缺血再灌注损伤可在多种情况下发生,如肾移植过程中循环血容量减少、循环停止或缺血时间。在肾缺血再灌注损伤,有关分子模式(抑制),包括退化坏死的管状细胞的DNA,刺激了先天免疫系统,激活中性粒细胞,导致NETosis和DNA和其它抑制的进一步释放,导致坏死性炎症的恶性循环。此外,长期炎症巨噬细胞,识别坏死的小管细胞和DAMPs,可能导致纤维化和慢性肾脏疾病的发展。


氢气抗氧化或抗炎作用,及其作为活性氧(ROS)清道夫,血小板粘附抑制剂,和抑制缺血再灌注损伤等作用在一些啮齿动物模型几个器官已报告。我们在猪肾移植模型中发现,储存在含氢灌注液中可以改善缺血肾移植的短期功能,并抑制长期排斥反应。我们通过猪肾缺血再灌注损伤模型研究了吸入氢气是否可以减少肾缺血再灌注损伤和防止长期肾纤维化。然而,确认长期结果的实验在繁殖和其他费用方面非常昂贵,并且在观察期间由于缺血再灌注损伤导致动物死亡的风险增加。因此,需要一种能够安全诱导缺血再灌注损伤,并能以少量实验动物提供大量数据的模型。


已经通过多种方式诱导了猪模型的肾脏缺血再灌注损伤,包括心脏骤停(诱发心室颤动)、主动脉阻塞和肾血管夹紧。同时双侧肾缺血或单侧肾缺血再加上对侧肾切除模型只提供了肾脏对单一缺血时间的反应的数据。此外,肾血管夹闭120分钟或更长时间,连同对侧肾切除,会对肾脏造成不可逆转的损害,并增加动物的死亡率。


       这项研究开发了一种新型猪缺血再灌注损伤模型。允许对引起长时间的缺血时间120分钟和随后的再灌注损伤进行观察,而不担心肾脏缺血导致的动物死亡。我们从过去一个猪肾应对两次缺血,变成对左和右肾分别缺血120和60分钟。在这个模型中,肾脏在缺血再灌注损伤后立即释放的DAMPs (DNA)和随后的长期肾纤维化随着缺血时间的增加而增加。利用这一新模型,我们研究了吸入氢气是否能减轻IR肾损伤。

吸入氢气方法

       4头猪中2头随机分为氢气组(氢气组n=2,对照组n=2)。氢组在肾血管松解前10 开始,持续到肾血管松解后30 min,鼻内吸入氢气,共40分钟吸入时间。在兽医麻醉面罩下,用手工制作的猪鼻插管吸入250 mL/min的纯氢气(100%)。在我们之前的研究中,我们证实了氢气的吸入浓度为8.3%10分钟吸入后血氢饱和浓度为6.7 -9.9%。猪在对照组不吸入氢气,其他治疗方法类似。

图1实验设计流程图

术后肾功能的病程

 

所有猪均存活至观察期结束。使用所有动物(氢组n=2,对照组n=2)的所有数据进行如下分析。血清肌酐和尿素氮水平见图2。血清肌酐和尿素氮水平升高到第1-3天,然后降至正常水平。我们观察到在第0天和第7天手术后的几天食欲减退,但逐渐恢复。氢气组和对照组的血液测试肾功能测量轨迹相似。

图2 不同时间肾脏功能指标改变曲线

缺血再灌注损伤急性期评估

缺血再灌注损伤释放的血浆DNA水平(缺血再灌注损伤后肾静脉水平与缺血再灌注损伤前下腔静脉水平的差异)在缺血120 min的肾脏中高于缺血60 min的肾脏,而在氢气组中下降(图3A)。


图3 早期肾脏HE染色典型结果

3B为第0天和第7天肾皮质HE染色的代表性图像。几乎所有肾皮质HE染色标本在第0天均显示严重的肾小管损伤,包括刷状缘缺失、铸型形成、肾小管扩张或坏死。这些发现在第7天略有改善(图4)。60分钟和120分钟组之间,或氢气组和对照组之间似乎没有差异。

图4 各组肾脏皮质病理评分统计

缺血再灌注损伤的慢性分期评价

 

84天肾皮质MT染色的代表性图像见图5A。与缺血60分钟组相比,缺血120分钟组MT染色的纤维化区域比例升高(图5B)。氢气组未见纤维化抑制。由于活检区域有部分瘢痕形成,因此在计算纤维化面积时将其排除在外(图5C)。

图5 晚期病理典型图

本研究通过对猪左、右肾进行不同的缺血时间处理,首次建立了猪缺血再灌注损伤模型,在不危及猪生命的前提下,延长缺血时间并再灌注损伤。该模型允许我们观察一只猪在两次缺血后肾脏的不同反应。 

在这个模型中,从肾脏释放的降解DNA的数量、急性损伤和长期肾间质纤维化的标志,作为慢性损伤的标志,虽然这种差异没有统计学意义,但对缺血时间的反应似乎增加了。


对双肾应用不同的缺血时间有一些好处。首先,对左右肾应用不同的缺血时间可以提供两倍的信息,并将实验所需的猪数量减少一半,与同时进行的双侧缺血模型或切除或不处理对侧肾的单侧缺血模型相比。由于用猪做实验很昂贵,而且大多数研究人员负担不起大量的猪,所以从有限的猪身上获得全面的信息是可取的。第二,来自同一头猪的两个肾脏被认为几乎相同,它们的结果很容易比较。事实上,在本研究中,不同缺血时间的左右肾在肾缺血再灌注损伤的急性和慢性标记物上存在差异。第三,该模型可以降低猪在双侧肾缺血再灌注损伤诱导下的死亡率。在之前的综述中,有报道称,单侧肾切除伴对侧肾缺血120分钟会导致不可逆转的损伤,并增加动物死亡率。在本研究中,由于对侧肾脏仅轻度受损,所有动物均存活至观察期结束。在肾移植领域,由于全球器官短缺,局部缺血时间较长的边缘移植物的使用越来越多,热缺血时间超过120 min的肾也有机会使用。因此,针对这类临床场景的研究需要能够安全诱导长时间缺血超过120 min的模型。在本研究中,右、左肾分别缺血60和120分钟,缺血时间超过120分钟是有可能的,但也有不利之处。当随访包括肌酐或尿素氮在内的外周血样本时,很难解释左、右肾的混合结果。然而,在缺血再灌注损伤之前和之后,每个肾脏的状况可以通过分别采集肾静脉血或肾活检标本来评估,如本研究。仅从缺血再灌注损伤后立即采集的血液样本很难准确地确定长期结果。然而,展望未来肾缺血再灌注损伤的治疗干预,从再灌注损伤的肾脏流出的局部血液可以用于研究,以寻找新的生物标志物或分子机制作为治疗靶点。因此,有必要根据目的选择合适的模型。


关于吸入氢气对肾脏缺血再灌注损伤的影响,氢组在缺血再灌注损伤发生后立即抑制了肾脏中DNA的释放,尽管这在每组n=2时还不能确定。这被认为是由于抑制小管细胞坏死和随后的坏死性炎症。本研究中以皮质为重点的活检病理未显示管状损伤评分存在差异。然而,我们之前对第3天缺血60分钟的髓质样本的评估显示,缺血后髓质样本有轻微但显著的下降(图S1,S2)。本研究无法从统计学上证明氢气对缺血再灌注损伤后长期肾纤维化的影响。众所周知(氢气研究可以用“众所周知”来描述了),氢气可以清除ROS,抑制血小板粘附,并减少各种啮鼠动物模型中某些器官的缺血再灌注损伤。也有人认为,治疗药物对缺血再灌注损伤的反应不同,在大小动物中是由于免疫系统的差异。这是急性肾损伤炎症反应的主要组成部分。需要在大型动物中进一步研究氢气是否对肾缺血再灌注损伤有抑制作用,以及何时和如何给药。


本研究有几个局限性。首先,由于成本高,我们只能使用四头猪。由于样本量小,我们无法在新模型中对缺血时间或氢气对预后的变化进行统计分析。第二,由于第0天和第7天的活检是切除楔形肾实质,标本中不含髓质,因此我们无法评估髓质。采用穿刺活检而不是楔状活检,可以对髓质进行评估,并且在这方面可能产生更彻底的结果,因为据报道肾缺血对髓质的影响大于对皮质的影响。第三,虽然远端缺血预适应的机制尚未完全揭示,但一侧肾缺血再灌注损伤有可能减轻另一侧同时诱导的肾缺血再灌注损伤。虽然这一问题可能适用于所有双侧肾缺血再灌注损伤模型,但本模型的结果需要更仔细地解释,因为在本模型中,左、右肾遭受了不同的缺血时间。本研究是建立新的肾缺血再灌注损伤模型的第一步。我们希望这一初步模型能得到进一步的开发和利用,为世界各地在有限的资金和设施下进行猪实验的研究人员提供可靠的数据。

 

综上所述,我们建立了一种新的猪肾缺血再灌注模型。应用不同的左、右肾缺血时间可以安全诱导延长缺血时间,降低动物负担和成本。氢气对肾缺血再灌注损伤的影响还有待进一步研究。